Menu

loading...

Impacto de las biotecnologías de reproducción: éxitos y fracasos en el siglo XXI

Impacto de las biotecnologías de reproducción: éxitos y fracasos en el siglo XXI

A partir de 1970 las biotecnologías han avanzado lo suficiente para realizar programas de ovulación múltiple (OM) y transferencia de embriones (TE) de ganado bovino en diferentes países. Estás tecnologías están establecidas en países desarrollados y en vías de desarrollo, con programas estructurados en las empresas ganaderas que buscan la mejora genética de las razas, además de contribuir a disminuir problemas reproductivos y sanitarios en los hatos (Martínez; Hasler).

Las biotecnologías se han caracterizado por el desarrollo de técnicas como la inseminación artificial (IA), OM y la TE, que contribuyen a incrementar de forma rápida la capacidad reproductiva y la mejora genética del ganado bovino (Romo). El primer éxito de la TE en mamífero fue en 1890, aproximadamente 60 años antes de que se informará de la tecnología básica de la TE en el ganado bovino (Hasler).

Desde la década pasada, se ha tenido la necesidad de multiplicar animales genéticamente superiores y adaptados a las condiciones adversas que presenta los trópicos, dado a la eficiencia reproductiva en vacas de alta producción de leche, que presentan una disminución en su fecundidad, la expresión del estro y la detección de estro (Baruselli et al; Wiltbank et al.).

2. Tratamientos hormonales reguladores de la función reproductiva

2. 1 Sincronización con progesterona. El desarrollo de métodos de sincronización de estros en bovinos con la manipulación del ciclo estrual que permitan hacer más eficiente la reproducción ha constituido un desafío para la medicina veterinaria. Para que los métodos de sincronización de celos en bovinos sean utilizados se debe tener en cuenta el costo de las hormonas utilizadas y el porcentaje de preñez, en definitiva tener en cuenta la relación costo/beneficio de los animales tratados. Según Patterson et al., la evolución de los métodos para el control del ciclo estral en la vaca, puede ser ordenado en cinco fases distintas. La primera comprende todas las investigaciones con el sentido de prolongar la fase lútea a través de la administración de progesterona exógena. La segunda refiere a que éstos métodos pasaron a contar con una asociación de estrógenos y gonadotropinas. La tercer fase está caracterizada por la utilización de prostaglandinas con el fin de acortar la fase lútea, la cuarta fase es aquella en la que fueron desarrollados los métodos con la asociación de progestágenos y prostaglandinas. La denominada quinta fase surgió por estudios de las ondas foliculares que mostraron que el control del ciclo estrual en la vaca requiere la manipulación no solo de la fase lútea sino también del crecimiento folicular. Diskin et al., señalan dos grupos de preparaciones hormonales disponibles en el mercado que pueden ser utilizadas para sincronizar celos en los bovinos:

1. Progestágenos que tienen como efecto principal un bloqueo hipotálamo-hipofisiario simulando una fase lútea.

2. Prostaglandinas y sus análogos que actúan como agente luteolítico sobre el cuerpo lúteo.

Independientemente de la vía de administración se ha observado que tratamientos con progestágenos por periodos largos, esto es, alrededor de 16 días, dan como resultado una mejor sincronización de estros pero con índices de concepción inferiores al 23%, en cambio, cuando el período de tratamiento es de aproximadamente de 7 a 9 días se obtiene peor sincronía pero con mejores índices de concepción superiores al 45% (Diskin et al.).

Se cuenta con una serie de progestágenos o dispositivos liberadores de progesterona y pueden ser administrados de manera oral, como el MGA (acetato de melengestrol); subcutáneos como el implante auricular con norgestomet; dispositivos vaginales liberadores de progesterona o progesterona inyectada vía intramuscular (Patterson et al.).

Existen diferentes tipos de dispositivos intravaginales, los cuales, contienen concentraciones variadas de progesterona, como por ejemplo: CIDR-B (1,9 g de progesterona), PRID (1,55 g de progesterona), DIB (1 g de progesterona), DISPOCEL (1 g de progesterona), etc. Uno de los más utilizados es el CIDR-B. Este dispositivo consta con un implante en forma de T de silicón con un molde de nylon impregnado con 1,9 g de progesterona. La mucosa vaginal absorbe aproximadamente 0,5 a 0,6 mg de progesterona al día, determinándose esta forma el bloqueo hipotalámico-hipofisiario.

El dispositivo es introducido en la cavidad vaginal a través de un aplicador semejante a un especulo que mantiene las extremidades de la T aproximadas a manera de facilitar su introducción. La extremidad distal del CIDR contiene un filamento de nylon que al final del periodo de utilización sirve para la remoción del dispositivo por tracción (Diskin et al.). Se ha reportado que la utilización de CIDR, estradiol y PGF2α reportan porcentajes de entre 85-90% de estro dentro de los primeros 4-5 días postratamiento (Macmillan et al., Diskin et al.).

2. 2 Sincronización con prostaglandinas. L a s prostaglandinas y sus análogos actúan como agente luteolítico, de tal manera que su acción es ejercida únicamente cuando existe un cuerpo lúteo funcional (días 7 al 16 del ciclo) en los ovarios. Todos los protocolos con prostaglandinas solamente son indicados para animales cíclicos, resultando en completo fracaso cuando se aplican en animales con deficientes condiciones nutricionales y en estado acíclico. (Hirsbrunner et al.). Esta hormona fue la base de los primeros métodos de sincronización de celos, aunque y varía de acuerdo al día del ciclo estrual en que se aplique (Cavestany). Por lo tanto, la inyección de prostaglandina es una manera de inducir selectivamente la regresión del CL de una manera similar al proceso normal (Gumen y Seguin).

Pursley et al., demostraron que el momento de ovulación en ciclos inducidos con prostaglandinas presenta grandes variaciones. Por este motivo la detección de celo se hace imprescindible cuando se pretende adoptar la inducción de ciclos con ovulación e inseminación artificial. En la sincronización de celos con el uso de la PGF2α o sus análogos existen protocolos como el que indican la utilización de dos dosis de la hormona aplicada con un intervalo de 10 a 12 días. La primera aplicación en ganado cíclico el efecto luteolítico normalmente se da aproximadamente en el 60% de las vacas (Bartolomé et al.). Con la segunda aplicación de prostaglandina se introduce en estro a la totalidad de los animales. A partir de las 48 h de la segunda aplicación se comienza a detectar celo e inseminar por 2 a 3 días (Callejas). Si se usa prostaglandinas en ganado que no se conoce su estado cíclico, puede resultar en un porcentaje de gestación con un rango del 30 al 70%. El principal factor que contribuye a esta variación es el porcentaje de vacas ciclando en el momento del tratamiento (Hirsbrunner). La utilización de prostaglandina para la sincronización de celos es una herramienta excelente (Cavestany); también es comúnmente usada durante el posparto temprano para mejorar la involución uterina y la fertilidad en el ganado lechero (Meléndez et al.).

Impacto de las biotecnologías de 2

 

 

2.3 Ovulación múltiple y recolección de embriones. La ovulación múltiple (OM) consiste en la inducción de más de una ovulación mediante la aplicación de hormonas que estimulan los folículos antrales produciendo un crecimiento intensivo, con la finalidad de que al momento de la inseminación, se produzca más de un embrión (Armstrong; Bó et al.).

De manera natural, una hembra bovina con condiciones de manejo y alimentación óptimas puede producir alrededor de 10 crías durante su vida reproductiva. Con la técnica de OM, se pueden obtener aproximadamente hasta 15 embriones cada “mes” de una sola hembra, y con la técnica de la TE éstos se pueden transferir a varias receptoras y así obtener 10 becerros por “mes” de la misma madre y de diferentes padres (Calva et al.). Los protocolos para los programas para inducir la OM han evolucionado de tal manera, que tienen como finalidad el duplicar el número de gestaciones promedio obtenidas por colecta habitualmente entre 2 y 3, e incrementar la frecuencia de colectas a 6 ó 8 por año (Baruselli et al.).

Las vacas en puerperio son incorporadas a los programas de ovulación múltiple después de 60 días posparto, que aseguren la involución uterina y el reinicio de la actividad ovárica. Las donadoras diagnosticadas vacías y en condición normal deben tener los ovarios funcionales con estructuras fisiológicas en su corteza, oviductos sin alteraciones, útero con cuernos de longitud adecuada, y cérvix recto (Cushman et al.).

Para realizar la OM se utiliza terapia hormonal a través de la hormona folículo estimulante (FSH), las cuales al contrarrestar los efectos de los estrógenos, hacen que en ambos ovarios de la vaca se desarrollen varios folículos dominantes.

Los tratamientos para la inducción de OM utilizan inyecciones de gonadotropinas exógenas en el diestro, en la mitad de la fase lutea (día 8 a 14), para reclutar folículos extra cerca del final de esta fase y ser ovulados en la siguiente fase folicular. Para que el tratamiento sea exitoso, se deberá tomar la segunda oleada folicular, que es cuando hay mayor número de folículos en crecimiento y ocurre en el día 9 ó 10 del ciclo para aquellos que tienen dos oleadas y entre el día 8 a 9 para aquellos que tienen tres y teniendo en cuenta que la vida media biológica de la FSH suprafisiológica en la vaca es de 5 horas ó menos, ésta debe ser inyectada dos veces al día (Mapletoft et al., Hasler). Sin embargo, en la actualidad se puede lograr la OM con la aplicación de 6 a 8 dosis similares o descendentes de FSH, pero con la finalidad de disminuir el estrés que se causa en la donadora y retirar el uso de estrógenos en los tratamientos, se han implementado nuevos protocolos como la utilización de la primera oleada folicular, y la aplicación de una sola dosis de hormona estimulante de la foliculogénesis en un vehículo de liberación lenta (Bo et al.). También se debe tener en cuenta que la respuesta estará dada por un adecuado número de folículos antrales sensibles al estímulo de las gonadotropinas administradas en el tratamiento de OM, y la ausencia de un folículo dominante, por lo que se ha utilizado la hormona Anti Mulleriana como un buen marcador endocrino de la población de folículos antrales pequeños, que constituyen el objetivo de la estimulación ovárica en la OM, la concentración plasmática de esta hormona medida antes del tratamiento varía entre donadoras y esta correlacionada positivamente con el número de ovulaciones y embriones transferibles producidos después de la ovulación múltiple (Monniaux et al.). Como parte del programa de OM se realiza la inseminación artificial a tiempo fijo de las hembras tratadas facilitando así el manejo y la programación de actividades e intentar obtener el mayor número embriones viables (Bó et al.). Los embriones se recolectan de la cavidad uterina 6 a 8 días después del estro, cuando están en etapa temprana de desarrollo (mórula o blastocisto). Para la recolección se emplea utilizan catéteres, filtros y medio de lavado. Los embriones recolectados pueden ser transferidos en fresco a hembras receptoras, inmediatamente después de su colección, o pueden ser congelados y almacenados en nitrógeno líquido por tiempo indefinido (Hasler).

Impacto de las biotecnologías de 3

 

 

2.4 Blastocelectomía. L a blastocelectomía es una técnica de micromanipulación aplicada a blastocistos la cual consiste en reducir de manera artificial el volumen del blastocele con la ayuda de micromanipuladores, una microaguja, una micropipeta de sujeción y un microscopio invertido (Motoishi). Alrededor del día 7 el embrión bovino se conoce como blastocisto el cual tiene una cavidad central llena de fluido llamada blastocele, los blastocistos expandidos tienen mayor cantidad de líquido en comparación con los blastocistos tempranos. Sin embargo, a medida que el desarrollo continúa se va dando lugar a un blastocisto expandido, el cual se caracteriza por un aumento en el tamaño debido principalmente al incremento en la cantidad de líquido en el blastocele haciendo que la masa celular interna se haga compacta y las células del trofoblasto se peguen a la zona pelúcida la cual se ve adelgazada (Mapletoff).

Un problema que se tiene es cuando los blastocistos expuestos a la vitrificación se encuentran en estadios de desarrollo avanzado (blastocisto expandido), entonces se obtienen tasas de sobrevivencia alrededor de un 35% (Cho et al.). En embriones humanos a pesar de las altas tasas de implantación y embarazo obtenidas luego de transferencias de blastocistos en fresco, la tasa de sobrevivencia baja luego de su criopreservación y descongelamiento, reduciendo las posibilidades de gestación (Vanderzwalmen et al.). Los resultados del congelamiento de blastocistos mediante un protocolo de congelamiento lento han sido variables, desde 29.8 a 62.6%, justificando la investigación de métodos alternativos (Menezo et al.). Los blastocistos expandidos tienen mayor cantidad de líquido en comparación con los blastocistos tempranos, en dicho blastocele se pueden formar cristales de hielo durante el congelamiento. Probablemente una inadecuada penetración de los crioprotectores o una velocidad muy baja de congelamiento promueva esta formación de hielo, dañando los embriones (Kaufman et al.). Se ha reportado que el blastocele de un blastocisto expandido puede ser colapsado con una pipeta de cristal con diámetro más pequeño al del blastocisto antes de ser vitrificado lo que dio como resultado una tasa de 91% de sobrevivencia, 65% en la tasa de embarazo y 61% en la tasa de implantación (Motoishi). Son et al., reportaron un incremento en la tasa de sobrevivencia de blastocistos de un 19.4% cuando el volumen del blastocele fue reducido artificialmente con una aguja.

2.5 Criopreservación. La congelación de células vivas es un proceso fisicoquímico complejo de transporte de calor y agua entre la célula y el medio que la rodea. La criopreservación de embriones se lleva a cabo mediante la exposición a temperaturas muy bajas. Con el enfriamiento se produce una disminución notable del metabolismo y ahorro energético, que son factores necesarios para la prolongación de la vida celular (Vila).

Impacto de las biotecnologías de 4

 

 

A l c o n s e r v a r embriones a temperaturas extremadamente bajas (-196°C en nitrógeno líquido) es posible detener casi por completo la actividad enzimática intercelular, respiración celular, metabolismo, crecimiento, multiplicación, etc.; es decir, reducir drásticamente la actividad fisiológica de la célula. Así es posible almacenar embriones durante un largo período sin afectar su viabilidad y sin causarles cambios genéticos (Schneider y Mazur; Tanaka et al.).

La criopreservación de material biológico tiene lugar usualmente en una solución acuosa, con diferentes solutos presentes. Las propiedades fisicoquímicas que rigen los eventos a los cuales está sometida la solución durante la congelación derivan de la concentración de solutos disueltos en ella. El punto de congelación de la solución es inversamente proporcional a la concentración de solutos presentes (Vila). Cuando la suspensión celular es enfriada y alcanza una temperatura entre -5 y -10°C se forman núcleos de hielo distribuidos aleatoriamente en el medio extracelular que darán lugar a regiones en fase cristalina. El hielo en el espacio extracelular coexiste con el agua líquida intracelular gracias a la membrana plasmática que constituye la barrera que detiene el crecimiento de cristales dentro de la célula. Cuando en el medio extracelular ocurre la cristalización se forma hielo puro dejando los solutos progresivamente más concentrados en la fracción líquida, a medida que el cambio de fase progresa. Así, las células en suspensión deben deshidratarse para mantener el equilibrio osmótico con un medio extracelular cada vez más hipertónico (Vila y García).

Existe una tasa de congelación óptima para cada tipo de célula debido a las diferencias de permeabilidad del agua, el coeficiente de temperatura de dicha permeabilidad y su relación superficie-volumen (Leibo). Con una velocidad de enfriamiento adecuada, la célula se deshidrata y concentra intracelularmente antes de alcanzar la cristalización, de tal forma que la posibilidad de congelación intracelular y consecuentemente de daño celular se minimiza (Mazur).

2.5.1 Criopreservación por curva lenta. La criopreservación por curva lenta es un procedimiento lento que expone al embrión, en diferentes fases del congelamiento, a la acción de diversos factores físicos, químicos y biológicos (Lopatárová et al.). Esto puede resultar en rompimiento de la zona pelúcida, de las membranas celulares y del citoesqueleto, presentándose alteraciones metabólicas. Tal daño celular lleva a pérdida del autocontrol de la célula y eventualmente a muerte celular por apoptosis o necrosis (Baguisi et al.). El mayor daño para las células embrionarias está dado por la formación de cristales de hielo intracelulares (Massip et al; Matsuoka et al.), que puede ocurrir bajo condiciones específicas de congelamiento y descongelamiento, que afectan la recuperación y supervivencia de las células embrionarias. El procedimiento de criopreservación por curva lenta requiere de equipo costoso y sofisticado (Lopatárová et al.).

El método de congelación estándar posibilitó a Wilmut y Rowson; obtener el primer ternero nacido de la transferencia de un embrión congelado. Al método de criopreservación por curva lenta se le han efectuado desde entonces distintas modificaciones tendientes a su simplificación. Los rangos de congelación más usuales consisten en un descenso de temperatura a un ritmo de 0.3- 0.5°C / min desde el momento en que comienza la formación de hielo, que suele ser entre los -5 y -9°C, hasta llegar a temperaturas de -33 a -40°C, y posteriormente pasar ya directamente al nitrógeno líquido el cual se encuentra a -196°C (Shaw et al.). Sin embargo, se debe tener en cuenta que a una temperatura entre -5 y –9°C puede haber un sobreenfriamiento en la pajilla con lo que se formarán cristales de hielo en el interior de la célula, dañando de esta manera sus organelos. Con la finalidad de evitar la formación intracelular de cristales de hielo se realiza el “seeding”, el cual consiste en que, una vez estabilizada durante 5 min la pajilla a una temperatura entre -5 y –9°C, se toca su pared con un objeto enfriado a –196°C y de este modo se cristaliza el líquido extracelular de manera controlada (Maurer; Kuwayam).

Impacto de las biotecnologías de 5

 

 

2.5.3 Vitrificación. La vitrificación es la transición de una solución acuosa del estado líquido al estado vítreo (sólido) sin pasar por el estado sólido cristalino (Fahy et al.). Éste fenómeno puede ser considerado como un incremento extremo de la viscosidad, que requiere de altas tasas de enfriamiento y calentamiento (Vajta y Kuwayama). En criobiología, el congelamiento ocurre en el rango de 0 a - 40°C, y es por encima de éste que se presenta el daño por congelamiento, representado principalmente por la formación intracelular de hielo (Wolfe y Bryant). El principio básico de la criopreservación es alcanzar estas bajas temperaturas para lograr la vitrificación intracelular, pero protegiendo a las células de los principales efectos dañinos propios del proceso, tales como la formación de hielo intracelular, daño a la membrana plasmática, deshidratación y toxicidad de los crioprotectores (Wolfe y Bryant; Lopatárová et al.).

Se han logrado avances significativos en el área de la criobiología para el almacenamiento embriones animales. Se ha demostrado que el enfriamiento rápido disminuye la sensibilidad al frío, por lo que se ha propuesto la vitrificación como el método de elección para criopreservar embriones bovinos (Kasai). Desde hace alrededor de un par de décadas la vitrificación se ha conocido como una alternativa para los métodos convencionales de criopreservación. Sin embargo, a pesar de que el concepto de vitrificación fue propuesto por primera vez en 1937 por Luyet para la congelación de células y tejidos, no tuvo el desarrollo suficiente porque se sabía poco sobre la tendencia de las soluciones crioprotectoras acuosas a formar cristales, además de que la orientación se daba más hacia el enfriamiento y descongelamiento rápidos de las células (Fahy et al.). El uso de la vitrificación para congelar embriones de mamíferos con resultados exitosos, fue descrita por primera vez por Rall y Fahy., quienes después de vitrificar embriones de ratón de 8 células, los cultivaron in vitro y posteriormente los transfirieron obteniendo nacimientos vivos en un 39.1%.

Durante la vitrificación, tres factores afectan la probabilidad de la formación de cristales de hielo: el volumen de la muestra, la viscosidad de la solución y la tasa de enfriamiento. Así, la probabilidad de que se formen cristales de hielo es directamente proporcional al volumen e inversamente proporcional a la viscosidad y a la tasa de enfriamiento (Arav et al.). El rápido congelamiento evita la formación de cristales de hielo y la fractura de la zona; los efectos tóxicos y osmóticos durante el descongelamiento son minimizados por la inmersión del capilar que contiene al embrión dentro de una solución de descongelamiento (Lopatárová et al.). La vitrificación es un método de criopreservación que emplea una alta concentración de crioprotectores y una velocidad de enfriamiento ultrarrápida (20000 a 25000 o más °C/min), produciendo un aumento en la viscosidad del medio que contiene el embrión, y provocando que cuando se congela el sistema embrión-medio las moléculas se dispongan de manera similar a las del vidrio (estado vítreo) (Rall), llevando a la solidificación pero sin formación de cristales de hielo (Fahy et al., Lopatárová et al.). Con este método se disminuye el tiempo de contacto entre el embrión y los agentes crioprotectores, con la consiguiente disminución de los efectos tóxicos y osmóticos, así como también se reduce el riesgo de que se produzcan lesiones por la exposición a bajas temperaturas debido al rápido paso por la zona de “temperatura crítica” (Watson y Morris; Vajta et al.).

La vitrificación simplifica de manera considerable el proceso de criopreservación, sin requerir de equipo costoso (Vajta et al.), y en particular de embriones producidos in vitro, los cuales son altamente sensibles al congelamiento debido a su alto contenido de lípidos (Vajta et al., Merton et al.). La vitrificación también ha resultado apta para el congelamiento de embriones en etapas avanzadas de desarrollo, incluyendo blastocistos eclosionados producidos in vivo o in vitro, en los cuales los métodos convencionales de criopreservación resultarían fatales (Vajta et al.).

Las soluciones de vitrificación pueden contener dimetilsulfóxido (DMSO), propilenglicol, etilenglicol y glicerol, solos o combinados, y en concentraciones muy elevadas (Vajta). En general, las mejores técnicas apuntan a la vitrificación con concentraciones muy elevadas del crioprotector (Etilenglycol hasta 5,5 o 6 M), equilibración a temperatura ambiente, enfriamiento superrápido en vapores de nitrógeno e introducción en nitrógeno líquido. Los embriones seleccionados para vitrificación se equilibran en dos o más pasos a temperatura ambiente en diferentes soluciones con concentraciones crecientes de crioprotectores.

El paso del embrión por la solución final de vitrificación no excede los 30 seg. La pajilla se sella y se mantiene en posición horizontal en vapores de nitrógeno durante 2 a 3 min (velocidad de enfriamiento 200°C/ min), para pasarla luego directamente al nitrógeno líquido (Donnay et al.).

Continuará…

 

 

 

 

 


Fuente: Felipe Montiel Palacios, Rodolfo Canseco Sedano, Oscar E. Zárate Guevara FMVZ, UV. Circunvalación s/n Esq.Yañez, C.P. 91710, Veracruz, Ver.

Modificado por última vez enMartes, 12 Abril 2016 10:04
volver arriba